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一种用于降糖降脂的中药复方提取物及其提取方法

发布日期:2023-02-06 14:28 作者: 点击:

一种用于降糖降脂的中药复方提取物及其提取方法

1.本发明涉及中药技术领域,具体而言,涉及一种用于降糖降脂的中药复方提取物及其提取方法。

背景技术:

2.2型糖尿病是由遗传和环境因素相互作用所引起的糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱,以血中葡萄糖水平长期增高为疾病特征的代谢性疾病。糖尿病是常见病和多发病,其发病率正随着人们生活水平的提高,人口老龄化和生活方式的改变而显著增加。预测2025年,全球糖尿病患者将达到总人口的5.4%。3.目前,市场上治疗2型糖尿病的西药大都作用于单一的药物靶点,在降血糖的同时往往也会产生相应的不良反应。而中药不良反应小,中医药治疗糖尿病是从多靶点、多环节、多途径调节糖脂代谢。因此,寻找有效的降糖中药越来越受到中医药研究者重视。连梅颗粒是国医大师伍炳彩教授以《温病条辨》连梅汤为基础,结合“从肝论治消渴”,总结临床经验化裁而来。由黄连、乌梅、麦冬、地黄、阿胶、黄芪、山药、玄参和苍术9味中药组成,对气阴两虚兼阴血不足证的2型糖尿病有显著效果。4.鉴于此,特提出本发明。

技术实现要素:

5.本发明的目的在于提供一种用于降糖降脂的中药复方提取物的提取方法,能够从连梅颗粒中获得有效部位。6.本发明是这样实现的:7.本发明提供了一种用于降糖降脂的中药复方提取物的提取方法,其包括:先用酸性溶液将含连梅颗粒的溶液ph调节至酸性,再用碱性溶液将其ph调节至碱性,得到的液体通过有机溶液萃取,获得的上层有机溶液中含有中药复方提取物。8.在可选的实施方式中,含连梅颗粒的溶液中水的体积为连梅颗粒质量的12-15倍。9.在可选的实施方式中,酸性溶液包括无机酸。10.在可选的实施方式中,无机酸为硫酸或盐酸。11.在可选的实施方式中,酸性溶液将含连梅颗粒的溶液的ph调节至2.0-2.5。12.在可选的实施方式中,碱性溶液包括无机碱。13.在可选的实施方式中,无机碱为氢氧化钠或氨水。14.在可选的实施方式中,碱性溶液将含连梅颗粒的溶液的ph调节为>7。15.在可选的实施方式中,有机溶液包括醇溶液。16.在可选的实施方式中,醇溶液为正丁醇。17.在可选的实施方式中,提取方法还包括将上层醇溶液进行旋蒸、真空冷冻干燥。18.本发明还提供了一种中药复方提取物,其由上述的提取方法提取获得。19.本发明还提供了上述提取方法提取获得的中药复方提取物在制备相关药物中的应用,相关药物包括降糖降脂药物。20.在可选的实施方式中,相关药物包括促进胰岛素受体通路关键蛋白irs1表达的药物。21.在可选的实施方式中,相关药物包括抑制非传导相关akt亚型akt1、远端信号通路的srebp-1脂代谢调节蛋白以及foxo1糖异生蛋白的表达的药物。22.本发明具有以下有益效果:23.本发明通过“醇-酸水提取法”去除连梅颗粒中的无效杂质,富集有效成分,并能最大限度的发挥各药味有效成分疗效。用本发明提供的中药复方提取物,进行了相关的药理实验,结果表明,该中药复方提取物可以有效改善由葡萄糖胺诱导的hepg2细胞胰岛素抵抗。而且该提取方法操作简单、重现性好、成本低,适宜推广化使用。附图说明24.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。25.图1为实验例中hepg2细胞在酸性正丁醇提取部位不同浓度下细胞活性;26.图2为实验例中ir-hepg2细胞在不同药物不同浓度下的葡萄糖消耗量;(其中,横坐标上的h+为酸性部位20μg/ml,10μg/ml;bu为正丁醇部位20μg/ml,10μg/ml;ea为乙酸乙酯部位30μg/ml;oh-为碱性正丁醇30μg/ml,水为30μg/ml;罗格列酮为50μm)27.图3为实验例中转录组测序结果(连梅酸性提取部位vs模型组)-差异基因表达go富集图;28.图4为实验例中转录组测序结果;其中a为(连梅酸性提取部位vs模型组)-差异基因表达火山图;b-d为转录组测序结果(连梅酸性提取部位vs模型组)-差异基因表达kegg通路图;29.图5为实验例中基因水平糖脂代谢的mrna表达情况。具体实施方式30.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。31.连梅颗粒是国医大师伍炳彩教授以《温病条辨》连梅汤为基础,结合“从肝论治消渴”,总结临床经验化裁而来。由黄连、乌梅、麦冬、地黄、阿胶、黄芪、山药、玄参和苍术9味中药组成,取乌梅生津液,止烦渴,敛气阴,顺肝脏曲直作酸之性;黄连善清胃火,厚肠胃以坚阴之性,二者相伍为君药,酸苦制甜,使火去而不烁真阴。玄参壮水制火,启肾水上潮与天;麦冬润肺生津,除烦止渴,以期金水相生,上下既济,养阴生津,润燥止渴。生地清热凉血,养阴生津,与玄参麦冬共启清热养阴之功能。消渴伤中,致脾胃之中气不足,下焦之元气不足,从而出现尿糖增多的现象,治以健脾阴并固肾精。黄芪既能升阳举馅,又可补肺气、泻阴火;山药不润不燥,补而不腻,即可补脾胃而益肺气,又能益肾强阴、补肾固精,二药配用,健脾益气生津,补肾涩精止遗,起因兼顾,使脾气健旺,下元固壮,漏泄自止。苍术醒脾化湿,与山药黄芪相伍,益气健脾。至此心火清,肾水复,肝阴充,消渴、麻痹均可愈。32.为了能够从连梅颗粒获取有效部位,本发明提供了一种用于降糖降脂的中药复方提取物的提取方法,即“醇-酸水提取法”,其步骤包括:先用酸性溶液将含连梅颗粒的溶液ph调节至酸性,再用碱性溶液将其ph调节至碱性,得到的液体通过有机溶液萃取,获得的上层有机溶液中含有酸性正丁醇提取部位(即中药复方提取物)。33.在本发明中,采用“醇-酸水提取法”是由于连梅颗粒配方中存在乌梅,调至酸性可使生物碱以生物碱盐类(离子)的形式存在于溶液中,后充分搅拌,反应一段时间后再加碱性溶液,可得到较纯净的生物碱,便于最大程度地提取所需生物碱。34.在一些实施例中,连梅颗粒的溶液ph调节至酸性后,反应时间为2-3h。35.在一些实施例中,含连梅颗粒的溶液中水的体积为连梅颗粒质量的12-15倍。36.具体地,含连梅颗粒的溶液中水的体积可以为连梅颗粒质量的12倍、13倍、14倍或15倍。较为优选地,含连梅颗粒的溶液中水的体积为连梅颗粒质量的12倍。37.在一些实施例中,酸性溶液包括无机酸,较为优选地,本发明中的无机酸为硫酸或盐酸。38.在一些实施例中,酸性溶液将含连梅颗粒的溶液的ph调节至2.0-2.5。39.具体地,酸性溶液可以将含连梅颗粒的溶液的ph调节至2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5。较为优选地,酸性溶液可以将含连梅颗粒的溶液的ph调节至2.2。40.在一些实施例中,碱性溶液包括无机碱。较为优选地,本发明中无机碱为氢氧化钠或氨水。41.在一些实施例中,碱性溶液将含连梅颗粒的溶液的ph调节为>7。42.在一些实施例中,有机溶液包括醇溶液。较为优选地,醇溶液为正丁醇。43.在一些实施例中,提取方法还包括将上层醇溶液进行旋蒸、真空冷冻干燥。44.在一些实施例中,真空冷冻干燥的冷凝温度为-20~-18℃,压强《10pa。45.本发明还提供了一种中药复方提取物,其由上述的提取方法提取获得。46.本发明还提供了上述提取方法提取获得的中药复方提取物在制备降糖降脂药物中的应用。47.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。48.实施例149.本实施例提供了一种用于降糖降脂的中药复方提取物的提取方法,其步骤如下:50.(1)取连梅颗粒冻干粉1kg溶于12l水中,先加入硫酸溶液将液体酸化,将ph调节至2.2。51.(2)向步骤(1)中酸化后的溶液中加入氢氧化钠溶液,将溶液的ph调节至7.5。52.(3)将步骤(2)得到的液体经正丁醇萃取,取上层正丁醇旋蒸和真空冷冻干燥后得到中药复方提取物。旋蒸采用的是室温下的旋转蒸发仪,经初步处理后可得约500ml左右的提取液,再放入真空冷冻干燥机,冷凝温度为-20℃,压强《10pa,得到浸膏状成品(约75g)。53.实施例254.本实施例提供了一种用于降糖降脂的中药复方提取物的提取方法,其步骤如下:55.(1)取连梅颗粒冻干粉1kg溶于12l水中,先加入硫酸溶液将液体酸化,将ph调节至2.5。56.(2)向步骤(1)中酸化后的溶液中加入氢氧化钠溶液,将溶液的ph调节至7.5。57.(3)将步骤(2)得到的液体经正丁醇萃取,取上层正丁醇旋蒸和真空冷冻干燥后得到中药复方提取物。旋蒸采用的是室温下的旋转蒸发仪,经初步处理后可得约500ml左右的提取液,再放入真空冷冻干燥机,冷凝温度为-20℃,压强《10pa,得到浸膏状成品(约75g)。58.实施例359.本实施例提供了一种用于降糖降脂的中药复方提取物的提取方法,其步骤如下:60.(1)取连梅颗粒冻干粉1kg溶于12l水中,先加入硫酸溶液将液体酸化,将ph调节至2.2。61.(2)向步骤(1)中酸化后的溶液中加入氢氧化钠溶液,将溶液的ph调节至8.0。62.(3)将步骤(2)得到的液体经正丁醇萃取,取上层正丁醇旋蒸和真空冷冻干燥后得到中药复方提取物。旋蒸采用的是室温下的旋转蒸发仪,经初步处理后可得约500ml左右的提取液,再放入真空冷冻干燥机,冷凝温度为-20℃,压强《10pa,得到浸膏状成品(约75g)。63.实施例464.本实施例提供了一种用于降糖降脂的中药复方提取物的提取方法,其步骤如下:65.(1)取连梅颗粒冻干粉1kg溶于10l水中,先加入硫酸溶液将液体酸化,将ph调节至2.2。66.(2)向步骤(1)中酸化后的溶液中加入氢氧化钠溶液,将溶液的ph调节至7.5。67.(3)将步骤(2)得到的液体经正丁醇萃取,取上层正丁醇旋蒸和真空冷冻干燥后得到中药复方提取物。旋蒸采用的是室温下的旋转蒸发仪,经初步处理后可得约500ml左右的提取液,再放入真空冷冻干燥机,冷凝温度为-20℃,压强《10pa,得到浸膏状成品(约75g)。68.实施例569.本实施例提供了一种用于降糖降脂的中药复方提取物的提取方法,其步骤如下:70.(1)取连梅颗粒冻干粉1kg溶于15l水中,先加入硫酸溶液将液体酸化,将ph调节至2.2。71.(2)向步骤(1)中酸化后的溶液中加入氢氧化钠溶液,将溶液的ph调节至7.5。72.(3)将步骤(2)得到的液体经正丁醇萃取,取上层正丁醇旋蒸和真空冷冻干燥后得到中药复方提取物。旋蒸采用的是室温下的旋转蒸发仪,经初步处理后可得约500ml左右的提取液,再放入真空冷冻干燥机,冷凝温度为-20℃,压强《10pa,得到浸膏状成品(约75g)。73.对比例174.将1kg连梅颗粒冻干粉溶于12l水中,但不调节ph,再加入乙酸乙酯进行萃取,萃取得到的部位通过真空冷冻干燥后得到中药复方提取物。旋蒸、冷凝干燥步骤同实施例1-5。75.对比例276.将1kg连梅颗粒冻干粉溶于12l水中,但不调节ph,再加入正丁醇进行萃取,萃取得到的部位通过真空冷冻干燥后得到中药复方提取物。旋蒸、冷凝干燥步骤同实施例1-5,最后得到浸膏状成品(约21g)。77.对比例378.将1kg连梅颗粒冻干粉溶于12l水中,然后用氢氧化钠溶液将其调节ph至12,2小时后再用硫酸溶液将其调至酸性,用正丁醇进行萃取后真空冷冻干燥制成浸膏。旋蒸、冷凝干燥步骤同实施例1-5。79.实验例80.实施例1提取的中药复方提取物降糖降脂的细胞实验81.(1)hepg2细胞活性分析82.将hepg2细胞以8000个/孔的密度种植于96孔板中孵育24小时左右,待细胞贴壁后,吸弃培养液,加入实施例1提取的中药复方提取物药液,使其终浓度为0、0.390625、0.78125、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml,每个浓度设置6个平行孔,另设培养基空白组和对照组。继续培养24小时后,使用mtt法检测细胞活性。83.(2)葡萄糖消耗实验84.同细胞活性检测,将hepg2细胞以每孔8000个种植于96孔板中,高糖完全培养基于培养箱中孵育24小时后,使贴壁的hepg2细胞暴露于含18mm葡萄糖胺的低糖完全培养基18小时,之后再将细胞分为空白对照组(con)、模型组(mod)、各个提取部位(即实施例1与对比例1-3)的高低剂量组(h、l)、以及罗格列酮组(r),处理24小时。随后再弃上清加入含有10nm胰岛素的低糖基础培养基再置入培养箱孵育6小时后,同时测每孔细胞活力,取上清液1.5μl,用葡萄糖试剂盒检测上清液中的葡萄糖含量,从而计算每组葡萄糖消耗量。85.每组上清液葡萄糖含量=(样品孔-空白孔)/(标准孔-空白孔)×标准品浓度(5.55mm/l);每组葡萄糖消耗量=(5.55mm/l-上清液含量);葡萄糖消耗量(校正)=(5.55mm/l-上清液含量)/细胞活力。86.(3)转录组测序87.将hepg2细胞以5×105个/孔接种于6孔板中每组4皿,以高糖完全培养基于培养箱中孵育24小时后,使贴壁的hepg2细胞暴露于含18mm葡萄糖胺的低糖完全培养基18小时,之后再将细胞分为空白对照组(con)、模型组(mod)、各个提取部位的高中低剂量组(h、m、l)、以及罗格列酮组(r),处理24小时。pbs洗涤两遍后收集细胞,trizol试剂提取总rna,检测细胞中各基因表达变化情况。88.(4)实时荧光定量pcr89.将hepg2细胞以5×105个/孔接种于6孔板中每组4皿,以高糖完全培养基于培养箱中孵育24小时后,使贴壁的hepg2细胞暴露于含18mm葡萄糖胺的低糖完全培养基18小时,之后再将细胞分为空白对照组(con)、模型组(mod)、各个提取部位的高中低剂量组(h、m、l)、以及罗格列酮组(r),处理24小时。pbs洗涤两遍后收集细胞,按trizol试剂说明书提取总rna,加无酶水溶解,按照5×all-in-one rt-mastermix试剂盒说明书进行逆转录,接着使用sybr green mix试剂(tsingke)在qpcr系统中进行实施扩增,以actin作为内参进行相对表达丰度。90.(5)对小鼠血糖的影响91.首先构建小鼠2型糖尿病模型,选用高糖高脂配合链脲佐菌素(stz)腹腔注射,诱导其成模。具体步骤如下:92.1.选取4~5周龄km小鼠适应性饲养一周后开始灌胃高脂乳剂,每天一次400μl,连续灌胃4周后,小鼠禁食不禁水12h。其中高脂乳剂的成分为:猪油25.0g、胆固醇10.0g、葡萄糖40g、吐温(80)20ml、丙二醇30ml、水30ml、去氧胆酸钠2.0g、丙基硫氧嘧啶1.0g,调配后定容至200ml乳剂。93.2.造模组小鼠一次性注射stz溶液100mg/kg,stz临用前用0.1mol/l柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,调节ph至4.21,配置成2%的stz溶液上述操作均在冰浴中进行,正常组按照体重注射等量的柠檬酸-柠檬酸钠溶液。94.3.待小鼠成模后随机分配后进行灌胃给药,正常组、模型组灌胃生理盐水,部位高中低各组按照789mg/kg、394.5mg/kg、197.3mg/kg浓度灌胃给药,阳性药格列美脲组按照2mg/kg灌胃给药。连续操作36天后,测量小鼠的糖化血红蛋白值(硼酸亲和液相层析/色谱法),如表1所示。95.(6)统计分析96.使用graphpadprism软件8.0分析数据,并以平均值±sd表示。使用单因素方差分析(anova)确定统计显著性,然后使用tukey检验进行多重比较,p<0.05被认为具有统计学意义。97.实验结果如下:98.1.中药复方提取物对hepg2细胞活性的影响99.如图1所示:mtt法测定该提取部位给药24小时的细胞活力,结果显示,给药剂量在25μg/ml以下时,无明显的细胞毒性,故选择20μg/ml、10μg/ml的剂量进行后续的葡萄糖消耗实验。100.2.中药复方提取物对葡萄糖胺诱导的ir-hepg2细胞的葡萄糖消耗量影响101.如图2所示,采用葡萄糖胺诱导hepg2细胞构建ir细胞模型,以葡萄糖胺诱导18小时后,与正常组相比,模型组葡萄糖消耗量明显下降,给予不同剂量的各个提取部位分别处理细胞24小时后,与模型组相比,酸性正丁醇提取部位(即中药复方提取物)、正丁醇提取部位可以促进hepg2细胞对培养基中葡萄糖的吸收利用,优于乙酸乙酯部位、碱性正丁醇提取部位以及水层提取部位。102.3.如图3和图4所示,中药复方提取物可能通过pi3k-akt通路调节creb蛋白,从而促进细胞内的脂质代谢,改善细胞胰岛素抵抗。103.4.中药复方提取物调节ir-hepg2细胞糖脂代谢相关因子的mrna表达,如图5所示,经中药复方提取物给药后,ir-hepg2细胞内的irs1、akt1表达量分别有所改变,分别是增加胰岛素受体通路关键蛋白irs1的mrna表达以及减少非传导相关akt亚型akt1的表达量;还包括抑制远端信号通路的srebp-1脂代谢调节蛋白转录基因以及foxo1糖异生蛋白转录基因的表达。104.5.不同处理方式对小鼠血糖的影响如表1所示:105.表1小鼠糖化血红蛋白hba1c的检测结果[0106][0107]从表1可以发现,与正常组相比,模型组糖化血红蛋白hba1c明显上升,给予不同剂量的各个提取部位分别处理小鼠后,与模型组相比,高中低剂量组均能降低小鼠糖化血红蛋白hba1c含量,特别是高中剂量组。[0108]以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

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关键词:50葡萄糖的作用及用途

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